لیشمانیوز احشائی در اثر گونه‏هایی از مجموعه لیشمانیا دونووانی ایجاد می‏شود و از نظر اپیدمیولوژی به اشکال هندی، مدیترانه ای، آفریقائی و آمریکائی مشاهده می‏شود. لیشمانیوز احشایی ایران که نوع مدیترانه‏ای می‏باشد یک بیماری زئونوز است که عامل آن لیشمانیا اینفانتوم می‏باشد و توسط پشه خاکی از سگ و سگ‏سانان به انسان منتقل می‏شود. تاکنون لیشمانیوز احشائی از تمامی استانهای کشور گزارش شده است. بر اساس مطالعات اپیدمیولوژیک که تاکنون انجام شده است؛ این بیماری درمناطقی از استانهای اردبیل، آذربایجان شرقی، فارس و بوشهر به شکل آندمیک وجود دارد.

روش انتقال: مهمترین راه انتقال این بیماری از طریق گزش پشه خاکی‏های آلوده می‏باشد ولی مواردی از انتقال بیماری از طریق جفت از مادر به جنین، تماس جنسی، وسائل تزریقی آلوده و به طور نادر از طریق خون آلوده گزارش شده است.

علائم بالینی: لیشمانیوز احشائی ممکن است به اشکال بدون علامت، تحت بالینی، علامت‏دار، سندرم پوستی پس از کالاآزار، اشکال احشائی تروپیکال و نیز اشکال بالینی آتیپیک در مبتلایان به بیماری ایدز مشاهده شود.

تشخیص آزمایشگاهی: در حال حاضر معتبرترین روش تشخیصی انواع لیشمانیوزها، استفاده از روشهای انگل‌شناسی است و ارجح آن است که همه موارد لیشمانیوز توسط مشاهده انگل تایید گردند. از روشهای انگل‌شناسی به‌عنوان «استاندارد طلایی» برای ارزیابی دیگر روشهای تشخیصی نیز استفاده می‌شود. متاسفانه تهاجمی ‌بودن روش نمونه‌برداری برای مطالعات انگل‌شناسی در مورد این بیماری، استفاده از این روشها را تا حدود زیادی با محدودیت روبه‌رو ساخته است.

نمونه‌برداری از ضایعات احشایی وانجام آزمایش‏های انگل‏شناسی

برای مشاهده مستقیم اجسام لیشمن می‌توان از سیستم رتیکولوآندوتلیال خصوصا از طحال، مغزاستخوان، کبد و غدد لنفاوی فرد بیمار نمونه‌برداری کرد. براساس گزارش سازمان جهانی بهداشت میزان حساسیت طحال برای مشاهده انگل لیشمانیا، 90 تا 98 درصد، مغز استخوان 54 تا 86 درصد، کبد حدود 60 درصد و غدد لنفاوی حدود 64 درصد است. علیرغم آنکه احتمال مشاهده آماستیگوت‌ها در نمونه تهیه ‌شده از طحال بیمار بسیار زیاد است ولی به‌علت خطرات و عوارض ناشی ‌از نمونه ‌برداری طحال، در حال حاضر در ایران، از نمونه‌های تهیه ‌شده از مغزاستخوانهای ایلیاک، استرنوم و تیبیا استفاده می‌شود. حساسیت تشخیص انگل درنمونه‌های تهیه ‌شده از مغزاستخوان به نحوه نمونه ‌برداری و تجربه فرد آزمایش کننده بستگی دارد. با توجه به اینکه در برشهای هیستوپاتولوژی اجسام لیشمن تغییر شکل می‏دهند، استفاده از این روش برای تشخیص قطعی بیماری با محدویتهایی همراه است. گسترشهای تهیه ‌شده را ابتدا با متانول خالص به ‌مدت 5/0 تا 1 دقیقه ثابت نموده و سپس با رنگ گیمسا (10%) به ‌مدت 30 دقیقه آنها را رنگ‌آمیزی می‌‏نمایند. پس‌از شستشوی آنها با آب معمولی، با استفاده از میکروسکوپ نوری و با بزرگترین درشت‏نمایی (X1000) به جستجوی اجسام لیشمن می‌پردازند. اگر پروماستیگوت‌ها در شرایط استاندارد کشت داده شوند، این روش حساسیت زیادی دارد، لذا توصیه می‏شود همراه با آزمایش مستقیم، کشت در محیط های اختصاصی خصوصا محیط NNN نیز انجام شود.

جهت کشت، مقداری از نمونه‌های تهیه ‌شده را با رعایت کلیه شرایط آسپتیک به محیط کشت منتقل و در دمای  24ـ ‌18 درجه سانتیگراد نگهداری می‌کنند. با توجه به گونه لیشمانیا و خصوصیات محیط کشت مورد استفاده، پس‌ از چند روز تا چند هفته شکل پروماستیگوت انگل در محیط رشد می‌کند. برای جلوگیری از تاثیر عوامل بازدارنده بر رشد انگل بهتر است مقدار کمی از نمونه (یک یا دو قطره) به محیط کشت منتقل شود. چنانچه پس ‌از دو هفته پروماستیگوت در محیط کشت مشاهده نشد، توصیه می‌شود مجددا یک پاساژکور انجام شود و چنانچه پس‌از دو هفته دیگر، انگلی در محیط کشت دیده ‌نشد، نتیجه کشت منفی تلقی ‌شود. برای جلوگیری ازآلودگیهای باکتریایی و قارچی استفاده از آنتی‌بیوتیکهای مناسب توصیه می‏شود.

روش‏های سرولوژی

در حال حاضر از روشهای سرولوژی به شکل گسترده جهت تشخیص آزمایشگاهی لیشمانیوز احشایی استفاده می‏شود.

الف) روشهای سرولوژی اختصاصی: در روشهای سرولوژی اختصاصی به میزان کمی سرم یا پلاسمای خون (حدود 10 میکرولیتر) نیاز است که آن را می‌توان به ‌وسیله لانست از نوک انگشت و یا پاشنه پای کودکان در لوله‌های میکروهماتوکریت تهیه کرد. روشهای مختلف سرولوژی برای جستجوی پادتن‌های اختصاصی بر علیه لیشمانیا استفاده شده است که از بین آنها با توجه به حساسیت، ویژگی، ارزش اخباری مثبت و منفی، کارایی، سهولت انجام آزمایش و صرفه اقتصادی روشهای زیر پیشنهاد می‏شوند. لازم به یادآوری است درآزمایشهای سرولوژی معمولا از پروماستیگوت‌های کمپلکس لیشمانیا دونووانی خصوصا  لیشمانیا اینفانتوم،که در محیطهای کشت اختصاصی به تولید انبوه رسیده‏اند، به ‌عنوان آنتی‏ژن استفاده می‏شود.

1- روش ایمونوفلوئورسانس غیرمستقیمIndirect FluorescentAntibody)=IFA) 

حساسیت و ویژگی این روش حدود90% می‏باشد و در شرایط آزمایشگاهی مناسب است. در سرم فرد مبتلا به لیشمانیوز احشایی پادتن اختصاصی ایجاد می‌شود و این پادتن با پادگن لیشمانیا که به ‌صورت دایره‌هایی به قطر یک سانتیمتر روی لام میکروسکوپی قرارداده شده ‌است، مجموعه پادگن ‌ـ‌ پادتن ایجاد می‌کند. در صورت افزودن پادتن ضد گلوبولین انسانی که با ماده فلوئورسین ایزوتیوسیانات نشاندار شده است (کونژوگه)، مجموعه حاصله در زیر نور میکروسکوپ فلوئورسنت به رنگ سبز درخشان مشاهده می‌شود. تعیین عیار مرزی به نوع آنتی‏ژن تهیه ‌شده، روش انجام آزمایش و حتی فرد قرائت‌ کننده بستگی خواهد داشت و لذا نتایج حاصله در مراکز گوناگون ممکن است با یکدیگر قابل مقایسه نباشند. مطالعات انجام ‌شده دردانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی تهران نشان داده‌اند که عیارهای 1:128 و بالاتر همراه با علایم اختصاصی لیشمانیوز احشایی می‌توانند نمایانگر بیماری لیشمانیوز احشائی باشند. آزمایش IFA  ممکن است با انگل‏ها و یا باکتری‏هایی مانند مالاریا، تریپانوزوما، سل و حصبه واکنش متقاطع داشته باشد و وجود عامل روماتوئید در خون و نیز پادتن‌های ضد هسته سلولها (لوپوس اریتماتوس سیستمیک) ممکن است باعث نتایج مثبت کاذب شوند. جهت انجام IFA می‏توان از کیت‏های تهیه شده داخلی و یا خارجی مورد تایید آزمایشگاه مرجع سلامت وزارت بهداشت و مطابق دستور العمل‏های مربوطه استفاده نمود.

2- روش الایزا (ELISA = (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

حساسیت این روش بین 80 تا 100% است ولی ویژگی آزمایش به فاکتورهای زیادی از جمله نوع آنتی‏ژن مورد استفاده بستگی دارد. اصول این روش مشابه ایمونوفلوئورسانس غیرمستقیم است، با این تفاوت که از یک سیستم آنزیمی (آلکالن فسفاتاز و یا پراکسیداز) و سوبستراهای اختصاصی استفاده می‌‌شود. در این روش از پلیت‌های ته ‌صاف مخصوص الایزا استفاده می‏شود و 100 میکرولیتر از پادگن تهیه ‌شده در بافر پوشش‌ دهنده (رقت 1:200) به هر چاهک می‌افزاییم و یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد و در اتاقک مرطوب نگهداری می‌کنیم و پس ‌از شستشو با بافر شستشو، هر پلیت را جداگانه در کاغذ آلومینیومی می‌پیچیم و پس‌ از بسته‌بندی در کیسه نایلونی در برودت 70- درجه سانتیگراد تا زمان مصرف نگهداری می‌کنیم. پلیت‌های مذکور را معمولا تا مدت 6 ماه می‌توان مورد استفاده قرار داد. جهت انجام ELISA می‏توان از کیت‏های تهیه شده داخلی و یا خارجی مورد تایید آزمایشگاه مرجع سلامت وزارت بهداشت و مطابق دستور العمل‏های مربوطه استفاده نمود. عیارهای مرزی بر اساس دستورالعمل هر کیت و نیز برخی محاسبات آماری خاص در نظر گرفته می‏شود.

3- آزمایش آگلوتیناسیون مستقیم (DAT = (Direct Agglutination Test

آزمایش آگلوتیناسیون مستقیم روشی ساده برای تشخیص لیشمانیوز احشایی می‏باشد و مطالعاتی که در مناطق بومی بیماری درایران و جهان انجام گرفته حساسیت این روش 100-95% و ویژگی آن 100-86% تعیین گردیده است. در این روش از فرم تاژکدار انگلهای لیشمانیا اینفانتوم بعنوان آنتی‏ژن استفاده می‌شود. آنتی ژن در مجاورت رقتهای گوناگون سرم یا پلاسمای فرد مشکوک به بیماری قرار داده می‌شوند که در صورت وجود پادتن اختصاصی پدیده آگلوتیناسیون ایجاد می‌شود. آخرین حفره‌ای که در آن حلقه آبی کامل تشکیل شده‌ باشد، به ‌عنوان عیار نهایی در نظر گرفته می‌شود. طبق مطالعات فراوانی که در واحد تک ‌یاخته ‌شناسی دانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی تهران انجام شده است، عیارهای 1:3200 و به بالا همراه با علایم بالینی اختصاصی به‌ عنوان ابتلای فرد به کالا آزار تلقی می‌‌شود. عیارهای 1:800 و به پایین منفی و عیار 1:1600 به‌ عنوان عیار مشکوک تلقی می‌‌شود که برای تایید باید یکبار دیگر به فاصله 3ـ2 هفته نمونه ‌برداری انجام شود و چنانچه افزایش قابل توجه عیار پادتن ملاحظه شود و در صورت بروز علایم بالینی اختصاصی، بیماری کالا آزار تأیید می‌‌شود.

تذکر: از سال 1375 آنتی‏ژن آگلوتیناسیون مستقیم (DAT) به طور فعال در آزمایشگاه لیشمانیوز دانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی تهران تهیه می‏شود و به کمک مرکز مدیریت بیماریها جهت تشخیص آزمایشگاهی و مطالعات سرو اپیدمیولوژی در مناطق اندمیک لیشمانیوز احشائی مورد استفاده گسترده قرار می‏گیرد.

۴- آزمایش سریع سرولوژی با استفاده از استریپ‏های تهیه شده از آنتی‌ژن نوترکیب rK39

از روش‌های سریع جستجوی آنتی‌بادی جهت تشخیص آزمایشگاهی لیشمانیوز احشائی می‌توان به دیپ ‌استیک‌های حاوی آنتی‌ژن نوترکیب rK39 اشاره نمود. از محاسن این روش‌ها سرعت انجام آزمایش است که معمولاً در مدت حدود 2 تا 10 دقیقه نتیجه آزمایش مشخص می‌گردد. اخیرا کیت‏های مخصوصی از آنتی‌ژن نوترکیب rK39 توسط شرکت‏های مختلف ساخته شده است که با یک قطره سرم یا خون کامل و یک قطره بافر یا سرم فیزیولوژی آزمایش انجام می‌شوند. مخلوط حاصله با استفاده از خاصیت کروماتوگرافی پس از برخورد با کونژوگه رنگی به سمت بالا حرکت می‌کند و در صورت وجود آنتی‌بادی اختصاصی با آنتی‌ژن rK39 ایجاد کمپلکس رنگی می‌کند که به شکل یک خط بنفش رنگ دیده می‌شود. نمونه مورد نظر علی‌رغم نتیجه مثبت و یا منفی به سیر خود ادامه می‌دهد تا به ناحیه‌ای که بوسیله ضد پروتئین A پوشانیده شده است برخورد نماید و ایجاد خط رنگی دیگری می‌نماید. این خط به عنوان خط شاهد در نظر گرفته می‌شود و وجود آن دلیل بر کافی بودن حجم نمونه و صحت انجام آزمایش است. از محاسن آزمایش Dipstick rK39 سرعت بالا و سادگی آزمایش است و جهت غربالگری  لیشمانیوز احشائی علائم دار کاربرد دارد.

ب) روشهای سرولوژی غیراختصاصی

این روشها بر پایه افزایش ایمونوگلوبولین‌های سرم خون استوار است و به هر دلیلی که میزان پادتن در خون افزایش یابد، نتایج حاصل از این روشها مثبت خواهند شد، لذا به‌عنوان روشهای غیراختصاصی تلقی می‌‌شوند. یکی از مهمترین این روشها عبارتند از:

آزمایش فرمل ـ ژل یا ناپیرآلدئید

در این روش یک میلی‌لیتر از سرم را با یک قطره فرمالین تجارتی (37%) مخلوط می‌‌کنند. چنانچه پس ‌از گذشت 3 تا 20 دقیقه سرم مورد نظر کدر شد و یا به ‌شکل لخته درآمد، نتیجه حاصله مثبت است و در غیر این صورت منفی تلقی می‌شود. این آزمایش غیراختصاصی است و به هر علت که پادتن‌های سرم افزایش یابند (مالاریا، حصبه، تب مالت و غیره) نتیجه این آزمون مثبت می‌شود. در مناطق دور افتاده و بومی بیماری، در صورتی که آزمایشهای اختصاصی انگل‌شناسی و سرم‌شناسی امکانپذیر نباشد، از این آزمایش اختصاصی‌ می‌توان استفاده کرد و در صورت وجود علایم بالینی و شواهد اپیدمیولوژیک، بیمار را می‌توان تحت درمان و مراقبت قرار داد. لوکوپنی همراه با افزایش نسبی مونوسیت‌ها و لنفوسیت‌های خون محیطی را نیز می‌توان به ‌عنوان یک روش غیراختصاصی برای تشخیص کالا آزار مد نظر قرار داد.

ج) روشهای مولکولی

در حال حاضر از روشهای مولکولی خصوصا PCR برای تعیین گونه انگلهای لیشمانیا استفاده می‌شود. در سالهای اخیر از روشهای PCR،PCR-ELISA و PCR Rapid fluorogenic برای تشخیص آزمایشگاهی لیشمانیوزها استفاده شده است که اکثرا نتایج مطلوبی به‌ همراه داشته‌اند. در حال حاضر روشهای مولکولی برای تشخیص آزمایشگاهی لیشمانیوز بیشتر جنبه پژوهشی دارند.

تشخیص لیشمانیوز احشایی در مبتلایان به ایدز

لیشمانیوز احشایی به ‌عنوان یک عفونت فرصت‌طلب مهم در میان افراد آلوده به HIV-1 به‌شمار می‌رود. مطالعات اخیر نشان می‌دهند تعداد سلولهای CD4 در 90% مبتلایان کمتر از 200 عدد در هر میکرولیتر خون است. پادتن ضد لیشمانیا ممکن است در این بیماران، قابل ردیابی نباشد، به ‌خصوص اگر ابتلا به بیماری ایدز پیش ‌از ابتلای فرد به لیشمانیوز ایجاد شده باشد. روشهای سرولوژی اختصاصی در بیماران با عفونت همزمان لیشمانیوز و ایدز، نسبت به بیماران با سیستم ایمنی سالم حساسیت پایین‏تری دارد (حساسیت این روش‏ها در این بیماران حدود 50% می‏باشد در صورتی که حساسیت این روش‏ها در بیمارانی که به عفونت HIV مبتلا نیستند، بیش از 90% می باشد). اصولا جستجوی آنتی‌ژن جهت تشخیص لیشمانیوز احشائی خصوصا در مبتلایان به ایدز بسیار اختصاصی‌تر از جستجوی آنتی‌بادی است. یکی از روش‌های سریع جهت جستجوی آنتی‌ژن لیشمانیا روش کاتکس (KAtex) است . آنتی‌ژن هدف در این روش مولکول کربوهیدراتی است (KDa20-5) که جزئی از ساختمان دیواره پروماستیگوت و آماستیگوت انگل است. در حال حاضر کیت تجاری توسط شرکت ,UK Kalon Biological با نام KAtex ساخته شده است. جهت انجام آزمایش، نمونه ادرار فرد مشکوک به لیشمانیوز احشائی را برای حذف موادی که باعث نتایج مثبت کاذب می‌شوند به مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار داده و پس از سرد شدن یک قطره (50 میکرولیتر) از آن را با یک قطره لاتکس مخلوط نموده که در صورت مثبت بودن نتیجه، واکنش آگلوتیناسیون پس از دو دقیقه ایجاد می‌شود که با چشم غیرمسلح قابل رؤیت است.

تشخیص آزمایشگاهی لیشمانیوز احشایی در مبتلایان به ایدز از طریق انگل‌شناسی به‌ کمک نمونه‌برداریهای غیرتهاجمی مانند آزمایش خون محیطی بیماران، آسانتر و حساستر است. انگلهای لیشمانیا در این ‌گونه بیماران معمولا در سیتوپلاسم مونوسیت‌های خون یافت می‌شوند. در گسترش خون محیطی رنگ ‌شده با گیمسا حدود 50% و در نمونه‌های رنگ‌آمیزی شده و یا کشت‌شده بافی‌کوت حدود 70 تا 75% موارد ممکن است انگلهای لیشمانیا مشاهده شوند. روشهای تهاجمی تشخیص انگل از قبیل پونکسیون مغز استخوان در این قبیل افراد از حساسیت بسیار بالایی برخوردار است، زیرا بار انگلی در این بیماران بسیار بالاست.